Por razones desconocidas, Antonio Pérez jugó con las ya tensas relaciones entre Felipe II y su hermano Juan de Austria e hizo aparecer a los ojos del rey como subversivas las pretensiones de éste acerca de Inglaterra. Pero Felipe II ya desconfiaba de su secretario, por lo que en 1578, Juan de Escobedo (secretario de Juan de Austria) llegó a la Corte para explicar la posición de su maestro al rey, lo cual podía dejar al descubierto a Antonio. Por ello, Antonio culpó a Escobedo por las ambiciones de don Juan y aconsejó al rey eliminarlo. El rey parece que accedió a que Escobedo fuese eliminado. Antonio Pérez primero hizo un intento fallido de envenenamiento y luego contrató un grupo de asesinos que acabaron con la vida de Escobedo en Madrid el 31 de marzo de 1578. Pronto se esparció un rumor acerca de su implicación en el asesinato de Juan de Escobedo. Felipe II intentó en un principio proteger a Antonio Pérez, en parte por su propio sentimiento de culpabilidad y en parte por lo que podía revelar, pero cuando su hermano don Juan murió y sus documentos llegaron a Madrid, descubrió la trama y mentiras de Antonio Pérez, dándose cuenta de que don Juan siempre había sido leal. Considerándose traicionado, Felipe II empezó a desconfiar de la asociación de Antonio Pérez y la princesa de Éboli y sospechaba de un tráfico de secretos de Estado. En la noche del 28 de julio de 1579, Antonio Pérez fue detenido tras salir de su despacho. La princesa de Éboli, asimismo, fue puesta bajo custodia, primero en la Torre de Pinto, luego en el castillo de Santorcaz y, finalmente, fue recluida en su propio palacio de Pastrana, donde pasó el resto de su vida.
Poco después el puesto de Antonio Pérez fue ocupado por Granvela. Antonio Pérez tenía libertad para moverse por Madrid, siendo vigilado por la Corona, pues el rey necesitaba sus documentos (los cuales podían implicarle a él también en el asesinato de Escobedo). Más tarde, los Escobedo y sus aliados, tras presionar en la Corte, consiguieron que Antonio Pérez fuera detenido por segunda vez en 1585 bajo los cargos de tráfico de secretos y corrupción (sin mencionar el asesinato); fue encontrado culpable y condenado con dos años de prisión y una enorme multa. En 1590 reconoció bajo tortura su implicación en el asesinato de Escobedo.
(Pasajes de la historia)