En 1455 contrajo matrimonio con su primo el rey Enrique IV de Castilla, al cual acababan de declarar nulo su matrimonio con Blanca de Aragón. Tras siete años sin hijos, Juana dio a luz en 1462 a una niña que fue también llamada Juana (1462-1530).
Los adversarios de Enrique IV le había llamado "el Impotente", no tanto por no haber tenido descendencia de su primera esposa, Blanca de Navarra, como por ser de dominio público la dejación que hacía de sus obligaciones conyugales. Aún hoy día se plantean dudas sobre su heterosexualidad, sin embargo es algo que siempre ha quedado entre la historia y la leyenda. De hecho, los primeros rumores acerca de la supuesta homosexualidad del rey surgen cuando nació Juana, pues los nobles castellanos opuestos al rey pretendieron hacer creer que la niña era hija del noble Beltrán de la Cueva, privado de Enrique IV, por lo que a la niña se le dio el apodo de Juana la Beltraneja.
Es en esos momentos cuando surgen toda clase de rumores, incluida la homosexualidad regia, como forma de deslegitimar al rey. Es decir, como arma política. Incluso algunas fuentes incluyen la forma en que habría dejado embarazada a la reina, mediante una precoz técnica de inseminación artificial utilizando una cánula de oro (per cannam auream), y otras descripciones físicas que permitieron a Gregorio Marañón realizar su Ensayo biológico sobre Enrique IV de Castilla y su tiempo (Madrid 1930), que diagnosticó al rey de displasia eunucoide con reacción acromegálica, y que en la actualidad se define como una endocrinopatía, posiblemente un tumor hipofisario, manifestando litiasis renal crónica, impotencia, anomalía peneana e infertilidad, además de caracteres psico-patológicos.
A la muerte de Enrique IV, el 11 de diciembre del año 1474, la reina Juana sostuvo los derechos sucesorios de su hija pero falleció algunos meses después, a los treinta y seis años de edad, el 13 de junio de 1475.
Juana de Portugal tuvo por amante al caballero castellano Pedro de Castilla y Fonseca (biznieto de Pedro I de Castilla). Esta relación se dio incluso cuando aún estaba casada con el rey, lo que fue conocido en la época. Con él tuvo dos hijos gemelos, antes de fallecer con solo 36 años: